Polymerase Chain Reaction (PCR)

El método más común utilizado actualmente para desarrollar este tipo de investigaciones es la técnica de la Polymerase Chain Reaction (PCR), llamada en castellano Reacción en Cadena de la Polimerasa.

Esta tecnología, que ha revolucionado la investigación básica y el diagnóstico de laboratorio, es una forma simple y especialmente rápida de multiplicar el ADN presente en diferentes muestras biológicas y, al permitir la obtención de millones de copias de una determinada secuencia de ese ADN, posibilitar su identificación.

Cabe mencíonar que esta técnica fué desarrollada por el químico Kary B. Mullis (en 1985) quien ganó por sus trabajos el premio Nobel de química en el año 1993.

Explicado de forma muy simplificada la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) consta de tres pasos básicos:

El primero es la desnaturalizacion por calor del ADN a estudio. Luego de desnaturalizado el ADN, se realiza la separación fisica de las dos cadenas (de acuerdo al modelo de Watson y Críck el ADN está formado por 2 cadenas complementarías) mediante la incubación de la muestra en alta temperatura (93-97ºC).

Estas permanecerán separadas y libres en la solución hasta que la reacción sea enfriada (35-4OºC) para permitir que los "primers '' o "sondas" (secuencias específicas complementarias que se añaden a la reacción) se unan a las secuencias blanco ó buscadas y se realize la hibridización (segundo paso).

El tercer paso consiste en la polimerización, elongación o extension del complejo (sondas + ADN ) mediante cambios cíclicos de temperatura repetidos un gran número de veces y por la acción de una enzima llamada "Taq DNA polimerasa" la cual es muy termoestable y que es la que en buena medida ha permitido la automatizacíón del proceso PCR en una forma relativamente sencilla.

A pesar de estos interesantes esfuerzos en el campo de la filogenia, el terreno que hay que abarcar es demasiado amplio y, aun hoy en día, no ha sido todavía posible consensuar un esquema que permita clasificar a las bacterias según éstos criterios.

El Bergey's Manual of Determinative Bacteriology fué siempre el pionero en la clasificación de las bacterias "fenéticamente" (similitud global) y con fundamentos utilitarios. R.G.E. Murray (de la University of Western Ontario) defiende en las primeras ediciones del manual que las bacterias pueden ser clasificadas en cuatro divisiones y siete clases. Las cuatro divisiones se basan en la presencia o ausencia de una pared celular y en la naturaleza química y estructura de esa pared. Estas divisiones corresponden principalmente a los grupos tradicionalmente reconocidos.

Gracilicutes (piel delgada) tiene paredes celulares gram-negativas

Firmicutes (piel resistente) tiene paredes celulares gram-positivas

Tenericutes (piel suave) son los mycoplasmas

Mendosicutes (piel con "defectos") son las Archaeobacteria

La clasificación planteada en el Bergey's Manual difiere considerablemente de aquélla basada sobre el esfuerzo por representar relaciones filogenéticas. Por ejemplo, los diversos grupos de bacterias fotosintéticas parecen ser, según los datos actuales, filogeneticamente diferentes, pero en el Bergey's Manual están agrupadas todas juntas.

De cualquier manera, en el propio Bergey's Trust (grupo editor de los Manuales Bargey's) son plenamente consciente de la forma en que están evolucionando estos asuntos y en la última edición del Bergey's Manual of Systematic Bacteriology han planteado abiertamente la necesidad de caminar hacia un sistema de clasificación filogenética más acorde con los descubrimientos actuales.


En relación con este tema, y a pesar de estar en inglés, lo que puede dificultar a algunas personas su lectura, hemos decidido incluir aquí, junto con el esquema anterior, dos pequeños programas ejecutables (.exe comprimidos en .rar) porque nos han parecido de un valor educativo ALTÍSIMO y de una sencillez absoluta para comprender el proceso:

pcr.rar
cycseqpc.rar

Al picar sobre los enlaces aparecerá una ventana en la que se os pregunta si quereis "abrir" o "guardar" en disco los ficheros.

Si seleccionais "guardar en disco", en algún directorio de vuestra elección (sistema que recomendamos), los ficheros quedarán en vuestro ordenador y podrán ser ejecutados cuantas veces querais para revisar una y otra vez su contenido.

Este precioso material lo hemos obtenido en la dirección: http://www.css.orst.edu/CLASSES/css43002/notes9.htm