Métodos de antibiograma basados en difusión

Los métodos de difusión se basan en la distribución homogénea del antibiótico sobre los medios sólidos de cultivo. En términos generales los antibióticos se impregnan en discos de papel que se colocan sobre placas de medio de cultivo en las que previamente se ha extendido la bacteria que se considera. Tanto la cantidad de antibiótico como el número de bacterias (inóculo) deben controlarse cuidadosamente. El antibiótico difunde por el agar creando un gradiente de concentración decreciente según se aleja del disco. La bacteria si resulta susceptible no crece en las inmediaciones del disco y forma un halo de inhibición . Dicho halo es más grande cuanto mayor es el grado de sensibilidad de la cepa al antimicrobiano.

Esta técnica, denominada de disco-difusión es fácil de realizar, barata, aceptada por los organismos de estandarización y abierta en el sentido que permite analizar cualquier microorganismo y cualquier antibiótico. Incluso puede aplicarse directamente sobre muestras clínicas en infecciones graves como la meningitis.

Los discos con antibiótico deben conservarse en frió. El inóculo para sembrar las placas suele ajustarse por turbidez y debe corresponder con el nivel 0,5 en la escala arbitraria de McFarland. Tras la incubación se miden los diámetros de los halos de inhibición y se interpretan los resultados con ayuda de los puntos de corte establecidos internacionalmente para cada microorganismo y para cada antibiótico.

El principal inconveniente es su carácter sólo cualitativo y su limitación en bacterias anaerobias y de crecimiento lento. También presenta problemas con antibióticos molecularmente grandes que difunden poco sobre el agar.

El sistema Epsilon-Test es un ingenioso método de antibiograma por difusión que en lugar de discos utiliza tiras de papel graduadas con valores de CMI e impregnadas con un antibiótico en forma de gradiente de concentración. La intersección del halo de inhibición con la tira de papel indica la CMI del microorganismo para dicho antibiótico.

Métodos de antibiograma basados en dilución

Son los métodos clásicos de antibiograma. En términos generales consisten en fabricar varios tubos de medio de cultivo con diferentes concentraciones del antibiótico en cuestión e inocularlos con la cepa que se estudia. Pueden utilizarse medios líquidos o sólidos. La CMI corresponde con el tubo de concentración más baja que logre inhibir el 90% del crecimiento bacteriano.

En función del soporte donde se realizan los sistemas de dilución se consideran métodos de macrodilución con tubos independientes y métodos de microdilución que usan placas integradas con múltiples pocillos en cada uno de los cuales se coloca una concentración diferente de antibiótico Los sistemas automatizados de antibiograma se basan en métodos de microdilución.

Los métodos de dilución son en muchos casos los de referencia por su mayor exactitud y por su carácter cuantitativo (CMI). Se utilizan para confirmar resultados de difusión y en los estudios de sinergia y antagonismo antibiótico. Son mas caros y más laboriosos. Tienen más facilidad para contaminarse y no son tan abiertos como la difusión en cuanto al número de antibióticos. Las técnicas de dilución no pueden aplicarse directamente sobre muestras clínicas y en ocasiones la interpretación de resultados es difícil.

La lectura del antibiograma se realiza por turbidez si el medio de cultivo es líquido y por recuento de colonias en medios sólidos. Una vez obtenida la CMI correspondiente a cada antibiótico se interpreta siguiendo los puntos de corte establecidos y la cepa se clasifica como sensible o resistente a efectos clínicos.

Sistemas automatizados

Los laboratorios grandes con muchas muestras clínicas están obligados a realizar muchas pruebas de antibiograma y necesitan sistemas automatizados que ahorren tiempo. Aunque existen muchos todos ellos se parecen bastante entre si. La inoculación, la incubación y la lectura están automatizadas. Se basan en métodos de microdilución e incluso algunos integran en el mismo panel pruebas bioquímicas de identificación de modo que ofrecen resultados completos de diagnóstico.

Antibiograma de microorganismos exigentes

Anaerobios

Pueden utilizarse técnicas de dilución (microdilución) y de difusión (Epsilon-Test). Sólo se realizan en aislamientos valorables clínicamente en los no existe intervención de microorganismos aerobios. Se utilizan medios de cultivo específicos muy enriquecidos porque suele tratarse de microorganismos exigentes. Se testan los antibióticos más eficaces frente a estos agentes. Por supuesto todos los métodos deben realizarse asegurando la ausencia de oxígeno.

Micobacterias

Las micobacterias crecen muy lentamente, lo que dificulta enormemente las técnicas de antibiograma y las limita a laboratorios de referencia. Existen varios sistemas pero ninguno de ellos esta estandarizado, de modo que hay que tomar los resultados con precaución. El más utilizado es el método de las proporciones que compara crecimiento en tubos con y sin antibiótico. El aumento en los últimos años del número de casos de tuberculosis hace que se trabaje cada vez más en la resistencia antibiótica de M.tuberculosis.

Hongos

Sólo se dispone de métodos estandarizados para levaduras. Aun no para hongos filamentosos. Son sistemas de microdilución en los que el crecimiento de la levadura se detecta por turbidez. Las técnicas de difusión tienen dificultades porque los antifúngicos difunden mal por el agar.