Requerimientos nutricionales y enzimas del metabolismo

Cada tipo de bacteria vive en condiciones ambientales diferentes adaptada al medio lo mejor posible. No todos los géneros utilizan los mismos sustratos como fuentes de energía, carbono o nitrógeno. Esta diversidad es útil para clasificar las bacterias. Por otro lado existen también gran diversidad de rutas metabólicas de obtención de dicha energía. Cada bacteria contiene enzimas propias y específicas de su especie. La presencia o ausencia de estas enzimas también tiene valor taxonómico.

El estudio de estas características fenotípicas se realiza mediante pruebas bioquímicas diseñadas específicamente que se aplican a los aislamientos bacterianos. Aunque se han perfeccionado gran cantidad de pruebas las más utilizadas son las que poseen mas poder discriminativo, es decir las que diferencian mejor a las distintas especies.

Catalasa

La catalasa es una enzima bacteriana que desdobla el agua oxigenada en oxigeno y agua. Constituye un sistema de defensa bacteriano frente a agentes hiperoxidantes como el peróxido de hidrógeno (agua oxigenada). La detección de esta enzima es fácil de realizar, basta con aplicar agua oxigenada sobre la colonia problema. La aparición de burbujas indica que existe catalasa produciendo oxigeno gaseoso. Nunca debe realizarse esta prueba en colonias sobre medios con sangre porque los eritrocitos también poseen esta actividad enzimática y podrían producirse resultados falsamente positivos.

La prueba de la catalasa diferencia por ejemplo dos grandes grupos de cocos gram positivos. Los estreptococos son catalasa negativos mientras que los estafilococos son catalasa positivos.

Oxidasa

La citocromo oxidasa es una enzima de la cadena de transporte de electrones en la ruta metabólica de obtención de energía de algunas bacterias. La detección de esta enzima se realiza mediante la aplicación de un disco impregnado de su sustrato conjugado a un sistema de color. Si el sustrato de la oxidasa es degradado se forma color violeta característico. Los bacilos gram negativos del grupo de las enterobacterias son oxidasa negativos, los del género Pseudomonas son positivos.

Citrato

Sólo algunas bacterias son capaces de utilizar el citrato como única fuente de carbono. Los tubos con medio de Simmons contienen este compuesto y un indicador de pH. Si la bacteria es capaz de degradar citrato provoca un descenso en el pH, lo cual hace virar el indicador de color verde a azul intenso. Dentro del grupo de las enterobacterias algunas son citrato positivas como Klebsiella y otras citrato negativas como Escherichia coli.

Ureasa

La urea está presente en el habitat de muchas bacterias. Es un compuesto tóxico para ellas, de modo que necesitan sistemas enzimáticos que la eliminen. La enzima ureasa desdobla urea en amoniaco, agua y dióxido de carbono. Los microorganismos que contienen ureasa forma amoniaco en los tubos con urea. El indicador de pH vira de color amarillo a rosa intenso. El test de la ureasa ayuda en la identificación de algunas especies como Proteus, Corynebacterium urealyticum y Helicobacter pylori.

Coagulasa

La coagulasa es el mejor método de diferenciar a Staphyllococcus aureus (coagulasa positivos) del resto de estafilococos (coagulasa negativos). Se trata de una enzima que constituye un factor de virulencia porque induce la agregación del plasma alrededor de la propia bacteria, dificultando así los sistemas de defensa del hospedador (fagocitosis y complemento). La determinación de coagulasa se realiza enfrentando la cepa problema al plasma sanguíneo. Si tras un periodo de incubación se forma un coagulo se trata de S.aureus.

Indol

El anillo indólico es el producto de la degradación de triptófano. Algunas bacterias son capaces de degradar este aminoácido formando indol que se detecta mediante el reactivo de Kovacs. Este compuesto reacciona con el indol formando un característico color rojo. Escherichia coli, la bacteria más frecuentemente implicada en procesos infecciosos, es indol positiva.

Bilis esculina

Los enterococos son un grupo de cocos gram positivos que pueden crecer en presencia de bilis y además son capaces de hidrolizar la esculina. Ambas características se producen al mismo tiempo prácticamente solo en este grupo de bacterias. Los tubos de bilis esculina cambian de color pardo a negro cuando se inoculan con especies del género Enterococcus.

Test de oxidación y fermentación de azúcares

Básicamente las bacterias pueden utilizar dos vías metabólicas diferentes para degradar azúcares. La vía oxidativa necesita oxígeno, la vía fermentativa no. Determinar si la bacteria utiliza uno u otro mecanismo es fundamental para su identificación. Los tubos OF (oxidación/fermentación) contienen un azúcar y un indicador de pH. La cepa problema se siembra en dos tubos OF y uno de ellos se cubre con aceite de parafina para evitar la presencia de oxígeno. Los microorganismos fermentadores del azúcar elegido crecen en ambos tubos porque esta ruta metabólica no necesita oxígeno. Los microorganismos oxidadores no crecen en el tubo sellado y sólo hacen en la superficie del tubo abierto. Si el microorganismo no metaboliza el azúcar no crece en ninguno de los dos tubos. La determinación de la vía metabólica es especialmente decisiva en la identificación de bacilos gram negativos. Las enterobacterias son fermentadoras de glucosa, mientras que Pseudomonas y Acinetobacter son oxidadores.

Los tubos de TSI (triple sugar iron) y Kliger (con sólo dos azúcares) combinan la determinación de la ruta metabólica de degradación de azúcares con la de producción de ácido sulfhídrico y de gas. El Kliger es un tubo de agar inclinado que contiene diez veces menos glucosa que lactosa. Los microorganismos fermentadores de glucosa y no de lactosa provocan el viraje del indicador de pH sólo en el fondo del tubo debido a la baja concentración de este azúcar. Los que fermentan ambos azúcares viran tanto el fondo como el bisel del tubo. Los no fermentadores crecen sin provocar viraje de color. Por otro lado el medio de Kliger contiene sales de hierro que precipitan en presencia de ácido sulfídrico. Este compuesto es generado por algunos bacilos gram negativos como Salmonella. También puede testarse la producción de gases comprobando la integridad del agar tras la incubación. Las bacterias productoras de gas rompen el medio de cultivo.

Degradación de aminoácidos

La capacidad de degradar aminoácidos por parte de las bacterias también constituye un criterio de clasificación. Los aminoácidos con mayor fuerza discriminativa son la ornitina, la lisina y la arginina (además del triptófano de la prueba del indol). Para testar la degradación de estas moléculas se utilizan medios líquidos específicos con indicadores de pH. La incubación se realiza en anaerobiosis porque las enzimas implicadas se inactivan en presencia de oxígeno.

Además de todos las anteriores existen más pruebas bioquímicas útiles en la identificación bacteriana. En principio siempre puede testarse tanto la capacidad para utilizar algún compuesto, como la capacidad para resistir agentes inhibidores.