Tinción de gram

A pesar de que fue desarrollada en el siglo XIX la tinción de gram es la más utilizada en el diagnóstico microbiológico. De hecho la información que ofrece relativa a la composición de la pared bacteriana es la base de todas las taxonomías en este reino.

Se trata de una tinción diferencial que distingue entre bacterias con pared gruesa (gram positivas) y bacterias con pared fina y membrana externa (gram negativas). La mayoría de las bacterias presentan una de estas dos morfologías generales.

La tinción de gram utiliza violeta de genciana como colorante primario. Tras su aplicación todos los microorganismos se tiñen de violeta. Después el lugol actúa como mordiente, acentuando la penetración del colorante primario. El tercer paso consiste en la aplicación del decolorante, una mezcla de alcohol y acetona que elimina el violeta excepto en las bacterias con pared gruesa. Por último el colorante secundario o de contraste, la safranina, tiñe de rojo las bacterias decoloradas, es decir las de pared fina. En resumen las bacterias gram positivas quedan teñidas de violeta y las gram negativas de rojo.

Tinción de Ziehl-Neelsen

También es una tinción diferencial. Se denomina tinción ácido-alcohol resistente y es específica para una serie de bacterias con estructura de pared particular, las micobacterias. La pared de las micobacterias no está basada en peptidoglicano como las bacterias gram positivas y gram negativas, sino en ácidos micólicos. Esta particularidad las hace resistentes a la decoloración con ácido y alcohol que no se produce en casi ningún otro tipo bacteriano.

 

La tinción de Ziehl-Neelsen utiliza tres reactivos. El colorante primario es la fucsina que tiñe toda la preparación de rojo brillante. Como mordiente se utiliza flameado de la preparación con el colorante. La solución decolorante elimina el colorante primario excepto el los bacilos ácido alcohol resistentes. (BAAR). Por último el azul de metileno tiñe de azul el resto de la preparación.

Esta tinción es útil en la detección de bacterias del género Micobacterium en muestras de esputo. La presencia de bacilos rojos sobre fondo azul constituye un diagnóstico casi definitivo de tuberculosis.

Tinción de esporas

Alunas bacterias son capaces de desarrollar formas de resistencia denominadas esporas como mecanismo de defensa a agresiones ambientales. Son estructuras de pared gruesa en las que el microorganismo logra soportar las condiciones desfavorables de calor, desecación, acidez, etc. Cuando las condiciones ambientales vuelven a ser favorables las esporas "germinan" y vuelven a generarse formas vegetativas. Sólo algunas bacterias son capaces de formar esporas y esta característica puede en algunos casos orientar el diagnóstico.

Están descritos varios métodos para teñir esporas. Quizás el más utilizado sea el de Wirtz-Conklin o tinción con verde malaquita. Este colorante se une fuertemente a las esporas gracias a la utilización de calor como mordiente. La fase de decoloración en este caso se realiza con agua abundante. Las formas vegetativas pierden el color verde y se tiñen con el colorante de contraste (fucsina o safranina).

La detección de esporas debe realizarse en cultivos con condiciones estresantes para la célula. Suelen utilizarse cultivos viejos en los que la escasez de nutrientes provoca la esporulación de las bacterias.

La presencia de esporas en el ámbito clínico no dirige hacia los géneros Clostridium y Bacillus. Algunas esporas se desarrollan sin deformar a la célula vegetativa. Otras si lo hacen y generan según la disposición formas centrales o terminales (palillo de tambor). La posición relativa y la morfología de la espora constituyen caracteres taxonómicos en las especies de ambos géneros.

Tinción negativa de cápsulas

Algunas bacterias presentan una capa externa a la pared denominada cápsula. Está compuesta de azúcares y proteínas. No es una estructura vital para la bacteria, de modo que es posible que bajo determinadas condiciones ambientales o del propio desarrollo genere cápsula y bajo otras no lo haga. Se ha comprobado que la presencia de cápsula dificulta de algún modo la fagocitosis de las bacterias, es decir las cápsulas constituyen un factor de virulencia de los microorganismos.

La detección de cápsulas en las bacterias también puede orientarnos en el diagnóstico de laboratorio, y es especialmente importante en el diagnóstico de meningitis producida por Cryptococcus neoformans.. Se trata de una levadura que provoca graves cuadros de meningitis en personas inmunocomprometidas, y su detección en LCR lo más precozmente posible es vital para la supervivencia del paciente.

La tinción de cápsula se denomina tinción negativa porque tiñe el fondo de la preparación y no el microorganismo. Desde el punto de vista formal no es una tinción propiamente dicha, porque no fija los microorganismos. Se parece más a una preparación en fresco. Su realización es sencillísima, consiste en colocar la muestra húmeda sobre el porta objetos y mezclarla con tinta china. La tinta cubre toda la preparación a excepción de las cápsulas. En el microscopio se observa el fondo negro y los microorganismos con cápsula sin color.

Existen otras técnicas de tinción que ponen de manifiesto más estructuras bacterianas. Es el caso por ejemplo de las tinciones de flagelos. No obstante no tienen demasiado interés desde el punto de vista del diagnóstico, y suelen realizarse más a menudo en investigación básica.