Exámenes en fresco

Los exámenes en fresco permiten visualizar los microorganismos sin necesidad de fijarlos ni teñirlos, y por tanto vivos. Los microorganismos en general no presentan demasiado contraste respecto al medio que les rodea. A pesar de ello es posible verlos sin necesidad de teñirlos gracias a la refringencia que despiden y sobre todo a su capacidad de movimiento en medios líquidos.

La visualización de bacterias en fresco puede realizarse mediante la técnica de la gota pendiente. Consiste en colocar una gota de la solución con la bacteria en suspensión en un cubreobjetos que se coloca invertido sobre un portaobjetos excavado. Con el objetivo de 40 aumentos pueden detectarse las bacterias en movimiento por la refringencia que desprenden. Es una técnica que apenas se utiliza en el diagnóstico microbiológico, porque ofrece muy poca información en cuanto a la estructura y composición de las bacterias. Solamente puede tener utilidad en la comprobación de la motilidad de los microorganismos.

Los exámenes en fresco si constituyen un arma potente de diagnóstico en las infecciones producidas por parásitos intestinales. Pueden detectarse huevos, quistes y trofozoitos que por sus características morfológicas pueden generar por si solas un diagnóstico definitivo. Las muestras de heces deben pretratarse antes de realizar la preparación en fresco con el fin de aclarar y concentrar los parásitos. Las infecciones producidas por Tricomonas vaginalis, un protozoo flagelado responsable de infecciones urogenitales, también se diagnostican mediante la visualización en examen en fresco directo del exudado uretral.

Tinciones

En muchas ocasiones la visualización en fresco es completamente insuficiente para distinguir a los microorganismos. Se hace necesario aumentar su contraste respecto al medio donde se encuentran. Para ello se utilizan las tinciones, que posibilitan la observación de la cantidad, tamaño, morfología y disposición relativa de los microorganismos.

Las tinciones suponen la muerte de los microorganismos. No puede detectarse la capacidad de movimiento en las preparaciones teñidas. Todas las tinciones tienen un paso previo de fijación al portaobjetos que se realiza con calor o con lavado en alcoholes (metanol). A continuación se aplican sustancias coloreadas que tiñen la superficie de los microorganismos.

Las tinciones se denominan simples cuando utilizan un solo colorante, o bien diferenciales cuando usan más de uno y tiñen de forma específica distintas estructuras bacterianas. Las tinciones diferenciales son las más utilizadas ya que ofrecen más información diagnóstica.

Todas las tinciones tienen el mismo esquema de realización. Pueden variar los colorantes, los tiempos de exposición o las técnicas de fijación:

Extensión. Consiste en obtener una película fina de la muestra sobre el portaobjetos. Si se parte de medio líquido simplemente se extiende una pequeña gota. Si se trata de una colonia nos ayudaremos de suero fisiológico estéril.

Fijación. Tras secar el porta las bacterias deben adherirse al cristal. Debe intentar conservarse lo más posible las estructuras nativas del microorganismo. Puede utilizarse calor (flameado), o bien alcoholes.

Coloración. Aplicación de los colorantes. Su elección depende del tipo de tinción. Es necesario controlar la concentración y el tiempo de exposición para que los microorganismos queden suficientemente teñidos y el fondo suficientemente claro

Lavado del exceso de colorante con agua. Tras el secado está listo para ver en el microscopio.