Métodos y técnicas habituales de cultivo y aislamiento

Todas las muestras clínicas deben sembrarse sobre medios que aseguren la recuperación de toda la gama de posibles etiologías del cuadro infeccioso en el paciente. En consecuencia en la siembra primaria deben elegirse medios generales y de enriquecimiento, aunque pueden incluirse también medios selectivos. Es conveniente incluir en la siembra medios líquidos por si el inoculo es pequeño y no se recupera ninguna colonia en las placas de medio sólido. Cada tipo de muestra se siembra en los medios adecuados para los agentes causales más frecuentes en cada cuadro infeccioso. Si se incluye en la petición gérmenes especiales como micobacterias u hongos deben sembrarse los medios específicos para cada uno de ellos.

En el diagnóstico microbiológico no sólo nos interesa detectar la presencia de patógenos, también es importante medir la abundancia de estos para valorar la trascendencia clínica de los aislamientos y para evaluar el éxito de los tratamientos antimicrobianos.

En la mayor parte de los casos una pequeña parte de la muestra es suficiente para el cultivo. Para sembrar medios líquidos basta con sumergir una parte de la muestra en el medio e incubar a temperatura adecuada. Estos medios rinden siempre cultivos cualitativos, se pierde información en cuanto al número de gérmenes en la muestra original. Es su principal inconveniente. Además no todos los microorganismos crecen igual de rápido, de modo que el predominio de uno puede enmascarar al resto. Tampoco es posible distinguir contaminaciones en función de su abundancia relativa a los patógenos de la muestra.

Los medios sólidos pueden proporcionar información cuantitativa de los gérmenes de la muestra porque el número de colonias crecidas en las placas es proporcional a la cantidad de microorganismos presentes en la muestra original. Para contar colonias estas deben crecer individualizadas en el agar. Para conseguirlo se aplica la técnica de agotamiento en placa que permite un recuento semicuantitativo del número de colonias, (escasas, algunas, bastantes y abundantes). Muchas muestras se siembran al mismo tiempo en medios líquidos y sólidos para aprovechar las ventajas de ambos.

Si se emplean asas de siembra calibradas pueden sembrarse volúmenes exactos de muestra, y por tanto obtener información plenamente cuantitativa sobre la cantidad de gérmenes en la muestra. Es el caso del cultivo de orina donde se siembran exactamente 0.01 ml de muestra que se reparte uniformemente por la placa de cultivo. Tras la incubación el número de colonias que aparecen multiplicado por cien refleja el número de bacterias por ml. de orina. La información cuantitativa es de vital importancia en la valoración del cultivo como representativo o no de infección urinaria.

Optimización del cultivo. Microorganismos exigentes

Los medios de cultivo una vez sembrados deben incubarse en condiciones fisicoquímicas ideales para el crecimiento bacteriano. Todas las bacterias patógenas para el hombre crecen óptimamente a 37º C, no obstante algunas son capaces de desarrollarse por debajo (psicrofilas) y por encima (termófilas) de dicha temperatura. Estas características pueden ser útiles en la identificación de algunas especies, por ejemplo Pseudomonas fluorescens logra desarrollarse a sólo cuatro grados de temperatura. La temperatura puede influir bastante en las características fenotípicas de las bacterias, de modo que la misma cepa puede o no producir pigmentos, puede cambiar sus vías metabólicas o incluso su morfología. Las bacterias formadoras de esporas de resistencia cambian drásticamente de estructura y metabolismo cuando aumenta la temperatura.

La temperatura óptima de crecimiento para los hongos es de 30ºC. Los hongos dimórficos crecen en forma de levadura a 37ºC (dentro del cuerpo humano) y en forma de hongo filamentoso a 30ºC (en el exterior).

Los gases con más importancia para el desarrollo bacteriano son el oxígeno y el dióxido de carbono:

En lo referente al primero algunas especies tienen absoluta necesidad, se trata de los aerobios estrictos. En contraposición otros no toleran su presencia, son los anaerobios estrictos. No obstante la mayoría de las géneros bacterianos patógenas son anaerobios facultativos, es decir capaces de desarrollarse con y sin oxigeno. Por último unas pocas especies necesitan atmósferas especiales para crecer, con bajas concentraciones de oxígeno. Son los microaerófilos.

En cuanto al dióxido de carbono la mayoría de las especies bacterianas crecen óptimamente con una concentración de entre un 5 y un 10%. Algunos requieren imperiosamente esa alta proporción para crecer como Streptococcus pneumoniae.

El pH óptimo para el crecimiento de la mayor parte de las bacterias patógenas se encuentra entre 6,5 y 7,5. Todos los medios comerciales de cultivo se ajustan a este rango a través de la utilización de sistemas tamponadores, por lo que la acidez del medio está controlada desde el momento de la siembra.

Aunque temperatura, gases y pH son los factores físicos más importantes para establecer las condiciones ideales de crecimiento, algunos grupos bacterianos presentan también otras exigencias adicionales. Cabe destacar las bacterias halófilas que necesitan concentraciones de sal muy elevadas para crecer. Desde el punto de vista clínico sólo el género Vibrio puede clasificarse dentro de este grupo, y aunque crece más con alta concentración de sal, también lo hace a concentraciones habituales.